Col-R0101 試劑盒應(yīng)用 本試劑盒采用利裂解液配方在 10 分鐘內(nèi)完成細(xì)胞和組織樣本的裂解、提取和純化。無需使用蛋白酶 K、無需低溫離心,無需使用有機試劑。該配方中含有 RNA 保護劑,能夠抑制RNA降解、保護RNA 完整,從而提高 RNA 產(chǎn)量。提取 RNA 可用于 RT-PCR、RT-qPCR、Northern Blot、分子克隆、文庫構(gòu)建等。 本試劑盒僅供研究使用,不可用于臨床、食品、化妝品等域。
保存條件
室溫保存一年。
自備材料
水浴鍋或金屬浴、無水乙醇、無 DNase 無 RNase 離心管、DNase I(2U/μL,或貨號QR0102)使用方法
1. 樣本處理
1.1 從動物組織中提取 RNA
1.1.1 取 20-100mg 樣本放入液氮中充分研磨后,加入 700μL 裂解液 C,顛倒混勻。或者取 20-100mg 樣本加入 700μL 裂解液 C,加入 1 顆鋼珠,放入組織研磨器中,研磨1-2 分鐘。備注:不同樣本中 RNA 含量差異很大,過多使用樣本容易導(dǎo)致堵塞,終導(dǎo)致RNA提取量下降。
1.1.2 55℃孵育 1 分鐘。
1.1.3 12,000rpm 離心 1 分鐘,取 500μL 上清。
1.1.4 加入 250μL 無水乙醇,充分混勻。按照步驟 2.1-2.7 操作。
1.2 從懸浮細(xì)胞中提取 RNA
1.2.1 細(xì)胞 1,000rpm 離心 5 分鐘,收集細(xì)胞沉淀。
1.2.2 細(xì)胞數(shù)量為<5x106個時,加入 500uL 解液 C。細(xì)胞數(shù)量為 5x106~1x107個時,加入 700uL 裂解液 C。輕輕吹打混勻。55C孵育 1分鐘。
1.2.3 12.000rpm 離心1 分鐘。
1.2.4 細(xì)胞數(shù)量為 5×10 6個時,取 450μL 上清。細(xì)胞數(shù)量為 5×10 6~1×10 7個時,取650μL 上清。
1.2.5 加入 0.5 倍體積無水乙醇,充分混勻。按照步驟 2.1-2.7 操作。
1.3 從貼壁細(xì)胞中提取 RNA
1.3.1 胰酶消化細(xì)胞后 1,000rpm 離心 5 分鐘,收集細(xì)胞沉淀。
1.3.2 細(xì)胞數(shù)量為<5×10 6個時,加入 500μL 裂解液 C。細(xì)胞數(shù)量為 5×10 6~1×10 7個時,加入700μL裂解液 C。輕輕吹打混勻。55℃孵育 1 分鐘。 1.3.3 12,000rpm 離心 1 分鐘。 1.2.4 細(xì)胞數(shù)量為><5×10 6個時,取 450μL 上清。細(xì)胞數(shù)量為 5×10 6~1×10 7個時,取650μL上清。1.2.5 加入 0.5 倍體積無水乙醇,充分混勻。按照步驟 2.1-2.7 操作。>為<5×10 6個時,取 450μL 上清。細(xì)胞數(shù)量為 5×10 6~1×10 7個時,取650μL上清。1.2.5 加入 0.5 倍體積無水乙醇,充分混勻。按照步驟 2.1-2.7 操作。
2. RNA 純化
2.1 全部加入 RNA 吸附柱中,12,000rpm 離心 1 分鐘,倒掉收集管中廢液。
2.2 向 RNA 吸附柱中加入 500μL 洗滌液 CW1,12,000rpm 離心 30 ,倒掉收集管中廢液。
2.3 向 RNA 吸附柱中加入 500μL 洗滌液 CW2,12,000rpm 離心 30 ,倒掉收集管中廢液。
2.4 重復(fù)步驟 2.3 一次。
2.5 12,000rpm 離心 2 分鐘,倒掉收集管中廢液。
2.6 將 RNA 吸附柱放入無 DNase 無 RNase 離心管中,加入 30-50μL 洗脫液C,室溫放置1 分鐘。
2.7 12,000rpm 離心 2 分鐘,得到 RNA 溶液,-80℃保存。
注意事項
1. 務(wù)必在超凈臺中進行操作,常換手套,防止 RNA 降解。
2. 盡可能使用新鮮樣本進行 RNA 提取。
3. 使用無 DNase 無 RNase 的吸頭和離心管,防止 RNA 降解,常更換吸頭,防止交叉污染。
4. 為了提高洗脫效率,可提將洗脫液 C 置于 65℃水浴后再使用。
5. 根據(jù)后續(xù)試驗需求,請使用 DNase I(貨號 QR0102)進行基因組清除。
15021202164
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